革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法。

革兰氏染色所需试剂：

1、结晶紫：作为初染剂

2、碘液：作为媒染剂

3、酒精：浓度为95%，作为脱色剂

4、番红：复染剂

步骤：

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤

第一步初染剂：使用结晶紫染色。

第二步媒染剂（Mordant）

加入复方碘溶液或称革兰氏碘液（Gram's Iodine）后会形成不溶性的结晶紫-碘（CV-I）复合体。细菌呈紫黑色。第二步是关键，它的目的是分辨细菌的革兰氏染色特性。若为革兰氏阳性菌，此复合体系结合于细胞壁之镁、核糖核酸（Magnesium Ribonucletic Acid），形成镁-核糖核酸-结晶紫-碘（Mg-RNA-CV-I）复合体，不易脱去。

第三步脱色剂（Decoloring Agent）

使用酒精（95%）脱色，试剂具脂溶剂（Lipid Solvent）和蛋白脱水剂（Protein Dehydrating Agent）之双重功能。此步骤对革兰氏阳性细菌无效，因为细胞壁上厚厚的细胞壁层阻隔了结晶紫-碘复合体的外渗，只能留在细菌体内。革兰氏阴性菌细胞壁层薄，会被脱色而成为无色。

第四步复染剂（Counterstain）

为了对比，在此之后会加入番红（Safranin）进行复染，革兰氏阴性菌成红色，而革兰氏阳性菌仍保有原来的紫色。

染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。

注意事项：

以酒精灯烘干玻片时，应避免热源持续对同一点加热，以免玻片破掉。

以蒸馏水洗去多余药品时，应避免直接冲洗到样品的位置，可将玻片与水平面呈一个角度，使蒸馏水由玻片较高处往样品处流去。

此实验的标准作法应于无菌的状态下操作。

本实验可以大肠杆菌和金黄葡萄球菌作为控制组。

更多技术文章推荐：

富尔根氏核染色液配置；

教你如何选购恒温水浴箱；

实验室脱色摇床；

水平摇床/脱色摇床；